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ATAC-seq:请叫我“温柔一刀”

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ATAC-seq:请叫我“温柔一刀”

发布日期:2019-09-25 作者: 点击:

ATAC-seq火热实验中

ATAC-seq(Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing)是研究染色质可接近性的一种表观技术,用于鉴定染色质中未被组蛋白组成的核小体缠绕保护的开放区域。这项技术自2013年被美国Stanford大学的William Greenleaf等人提出并粉墨登场后,迅速在表观技术中占有一席之地,每年以ATAC-seq为主要技术的文章发表数量逐年递增并呈指数增长,并且渐渐替代MNase-seq、FAIRE-seq及DNAse-seq在表观舞台上的角色,为大多数表观专家所喜爱。

ATAC-seq技术主要是利用Tn5这个可爱的转座酶对染色质开放区域进行“温柔”的切割,然后将切割后的片段进行建库测序及后续分析,得到染色质开放区域的调控因子,方便后续的进一步研究(附上一张ATAC-seq经典示意图)。

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为了进一步了解ATAC-seq,我们先来简单介绍下什么叫染色质开放区域。我们都知道,真核生物的染色质是被一系列的核小体组蛋白八聚体紧紧缠绕。大多数时候基因组中的染色质都是处于紧紧盘绕的状态,但是在基因调控过程中,一些区域的染色质调控重塑后会呈现出松散的状态,这部分无核小体的裸露DNA区域被称为染色质开放区域或染色质可接近区域。染色质的开放区域能被大量的具有调控功能的顺反元件结合,这些顺反元件结合到染色质开放区域后,能招募其他蛋白使得基因开始转录。

染色质的开放区域并不是静止不动的,在其动态变化过程中,捕获这些染色质开发区域,能帮助我们弄清楚核小体在基因调控中的位置动态变化、发掘基因组调控元件并尽可能的揭示基因的表达调控机制。

说了这么多,我们来进入正题好好了解下ATAC-seq中的Tn5转座酶,正是因为Tn5转座酶的特性及其特性利用,才让我们有了ATAC这项技术。

Tn5最早是在大肠杆菌中发现的,其包含三个抗生素的核心序列和两条倒置额IS50序列。IS50R和IS50L高度同源,只是IS50L上存在突变。IS50具有19bp的倒置末端(外末端OE和内末端IE),两倒置末端有7bp的不同,此倒置末端是转座酶的作用位点(见下图fig.1)。

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Tn5转座过程需要转座子的末端序列、靶DNA、Tnp和Mg2+。Tnp结合到Tn5的OE末端后,会形成两个Tnp-OE复合体,随后这两个复合体通过Tnp的C末端相互作用形成Tn5转座复合体,此时Tnp产生切割DNA的活性。到此,Tn5这把刀彻底成型。当Tn5转座复合体结合到靶DNA上时,Tn5转座复合体识别并攻击靶序列,将转座子插入到靶序列中(见下图Fig.2)。

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Tn5转座复合物包含两段包埋序列,在我们实验过程中,,在Tn5转座复合物识别染色质开放区域后给染色质开放区域的“温柔一刀”,会形成9bp的gap,需要在进行PCR扩增前,利用PCR聚合酶的特性先72℃延伸来将gap补起来,然后正常建库就行。

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ATAC-seq有非常好的技术优势,如起始量低,实验周期短,一次性获得染色质开放区域,但是它也有一点缺点,就是Tn5的切割作用并不能做到小李飞刀刀无虚发,它的温柔一刀跳跃至染色质上的包埋序列若两端是一致的,则在建库时会被损失掉。

尽管ATAC-seq登上表观舞台历史不长,但其在表观长河中表现十分优秀,下图为MNase-seq、FAIRE-seq及DNAse-seq和ATAC-seq的技术比较,可以明显发现ATAC-seq的优势以及其取代其他相关技术的必然。

ATAC-5.png

Tn5转座酶在ATAC-seq的发展道路上的不俗表现,使得表观科学家们对它关注度颇高,最近较为火热的CUT&Tag也是借了Tn5转座酶这把刀,迅速登上表观舞台,相信不久的将来也会在表观舞台上引起一阵 “腥风血雨”。

武汉爱基百客生物技术有限公司专注表观技术,为广大表观专家提供优质的表观技术服务。ATAC-seq技术我们已成功实验了各种样本包括新鲜细胞、组织及各种植物新鲜和冻存样本如水稻、拟南芥、番木瓜、香蕉等以及一些微生物样本如疫霉菌、稻曲菌等。

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疫霉菌的ATAC-seq结果展示

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水稻样本的ATAC-seq结果展示

值得注意的是,ATAC-seq中,样本的保存条件对实验结果很重要,新鲜样本和冻存样本以及冻存时间较久或反复冻融样本实验结果差异较大,下面以拟南芥为例来展示武汉爱基百客测试的数据:

1、文章中拟南芥的结果

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文库分布可以明显看到核小体分布情况,Reads在TSS上游明显富集

来源:Ou, J., Liu, H., Yu, J., et al. (2018). ATACseqQC: a Bioconductor package for post-alignment quality assessment of ATAC-seq data. BMC Genomics, 19(1), 169. doi: 10.1186/s12864-018-4559-3

2、武汉爱基百客测试数据

2.1 拟南芥新鲜原生质体

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 原生质体可以明显看到核小体分布,Reads分布在TSS上游显著增加

2.2 拟南芥冻存样本(3天)

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短时期冻存样品依然可以看到核小体分布,Reads在TSS-TES的分布也满足要求

2.3 拟南芥冻存样本(>6 month)

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冻存时间较长的样本看不到明显的核小体分布并且reads无TSS上游明显起峰趋势

3、peak数据及IGV视图结果

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peak数据表明原生质体、新鲜样品及短期冻存样本的peak数较多(40K-50K),符合Encode中指出的几万个Peak,长时间冻存样品则结果较差,peak数约3K。

对于不同条件保存的样本,原生质体、新鲜样品、新鲜冻存样品结果重复性较好,且实验结果显示原生质体>新鲜样品>新鲜冻存样品。

要做此项目的小伙伴,要注意哈,长期冻存样本就不太适宜做此实验了!

爱基百客潜心科研服务,专注更专业。ATAC-seq还有很长的路走,对于特殊组织及微生物样本爱基也已升级优化,欢迎选择爱基让科研更容易。



本文网址:/news/480.html

关键词:ATAC-seq,Tn5,染色质可接近性

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