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那些年ChIP-seq遇到的一些坑——第一弹:预处理的漩涡

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那些年ChIP-seq遇到的一些坑——第一弹:预处理的漩涡

发布日期:2019-06-17 作者: 点击:

       写在前面的话:ChIP实验做了多年的我们,公众号如此的单薄,我们的资深技术小姐姐实在看不下去了,决定来一系列直击灵魂深处的干货分享,快点来围观!

       记住,有件事一定要做,文末告诉你哦!

       染色质免疫共沉淀测序技术(Chromatin immunoprecipitation Sequencing, ChIP- seq)将染色质免疫共沉淀与第二代测序相结合的一种技术。它能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段,是研究体内转录因子和靶基因启动子区域直接相互作用的方法,对于调控蛋白在基因组上的结合靶点筛选、差异化表观遗传变异的原理揭示提供了重要的解决思路。因此,在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法,并且一大波的CNS都展示了完美的结果。那是不是ChIP-seq实验就点一下,So Easy呢?

       噢,NO! NO! NO! 小编总是接到很多客户的疑问:为什么我的染色质超声不下去?为什么我检测不到染色质的大小?为什么我做完IP后没检测到浓度?为什么IP之后验证不到目的基因?……辛辛苦苦做了整个实验,回头只发现了满地的坑……(尴尬),所谓一着不慎满盘皆输啊!


       没做过的小伙伴们会说,染色质免疫共沉淀测序技术也就是涉及到“染色质”、“免疫共沉淀”、“测序”么,听起来好简单噢。刚起步做,还未待一遍流程走完,只觉自己懵懂懂如堕五里雾中,想要获得理想的结果其实没有“辣么简单”。没关系呢,小编也是从这个时期走过的,那么今天就跟大家分享一下那些年ChIP-seq遇到的一些坑。


       Q1:我要做一次染色质免疫共沉淀需要多少的材料呢?


       A1:染色质的总产率直接影响着后期免疫沉淀的效果。到底要用多少的材料才能够做一次IP实验呢?在展开实验之前,首先要明确自己实验内容,要选择的目的抗体有多少?需不需要阳性对照和阴性对照?要不要做重复?确定好了研究的内容之后,就可以进行样本准备了。小编根据大量样本的实验总结了每类样本的大致用量(包括了目的抗体,阳性和阴性对照),供各位小主参考:

1.png

        Q2: 为什么实验中,染色质超声打断后还是片段较大?


        A2:提及片段化的影响因素首先会想到如下几点,比如:细胞数量、超声体积、超声片段大小、超声仪设置的功率和累计超声时间等,或者利用酶解方法中,酶的用量,buffer的成分等原因。我们先看两张图:


2.png


       图1和图2是同一份样本,同样的片段化条件,为什么超声后的结果却迥然不同?从图1可以看出,片段化之后的片段主要分布在100-2000bp;图2中染色质分布均匀在100-500bp,效果更好,即使将图1中的超声时间和功率都增加一倍,结果还是片段化较差。

       以上实验材料,除了交联时间不一样,其他所有条件都一样却出现了完全不同的实验结果。图1的交联时间为20 min,图2的交联时间为10 min。

       结论:为了稳定DNA和蛋白的相互作用,通常都会对样本进行交联。在前期交联样本的时候就要将交联时间控制到蕞佳,切勿交联时间过长使得染色质超声不下去,片段较大;也不能时间太短,使得染色质结合不紧密,丢失染色质上靶蛋白位点。

       建议:对于组蛋白或组蛋白修饰抗体:细胞及组织样本中交联样品10 min,植物样本通常真空交联样品15-20min;对于转录因子或辅因子,推荐交联10-30 min;

       Q3:为什么交联时间及片段化条件是按照文献提供方法做的,可是解交联了之后却找不到DNA的影子呢?

        A3:这种结果有多方面原因,我们还是以实际案例来说,如下两张胶图:


3.png

       图3解交联时间为3h,图4解交联时间为8小时,且加了蛋白酶K进行消化。说到这大家也应该能明白原因了。我们都知道染色质是由DNA+蛋白构成,在解交联之时,解交联时间过短,使得染色质上的DNA和蛋白没有完全分开,DNA被蛋白包裹,而蛋白质分子量较大,所以在胶孔中没有跑出来,而部分被解交联下来的DNA就正常的在琼脂糖胶中迁移,就形成了图3,片段化后的泳道隐隐约约能看到弥散的DNA,不能具体的看出DNA分布情况。当我们把解交联的时间延长,出现了图4就可以完全看出DNA片段分布,主要在100-500bp,效果还是很好的。

       除此之外,我们做过一些解交联方法的一些探究可供参考:


4.png

       Q4:我做的一些非常规样本,马铃薯的块茎,玉米的种子,番茄的果实,动物的脂肪组织,真菌的菌丝,按照标准的Protocol进行怎么做完预处理后就“凉凉”了?什么也没有?

      A4:目前较为成熟的ChIP实验主要集中在以细胞为研究对象中,动物、植物及真菌等有着自己独特的细胞学结构,特别是植物和真菌有细胞壁的构造,在裂解细胞释放核的过程较为困难,普通的细胞及核裂解液可能很难发挥较好的作用。这类疑难样本的处理,不建议参照已发表的方案而不进行优化。

      通常我们在接触此类样本的预处理时,获得较为纯净的细胞是必要的,如多层膜过滤,密度梯度离心。并且在染色质释放时要调整裂解液的配方,对于较容易处理的细胞或组织,采用较弱的表面活性剂处理,如NP-40等;对于难处理的组织类型,可用较强的表面活性剂,如SDS处理,并且可通过改变裂解配方中的表面活性剂的配比及浓度进行裂解。话不多说,直接上图给大家看下我们制服这些疑难杂症的结果:

5.png

        掌握了这些技巧,我们是不是可以在预处理环节避免入坑了呢?你遇见了哪些坑欢迎留言分享,有奖励哦!

        预知富集路上可能遇到的坑,且听下回分解…

        还记得一开始告诉你有件事一定要做么?

        躲坑秘籍,转发分享!




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关键词:基因表达定量,基因表达调控,表观组学技术服务

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