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水稻microRNA166的敲除赋予水稻抗旱性

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水稻microRNA166的敲除赋予水稻抗旱性

发布日期:2019-03-29 作者: 点击:

叶型是农作物的一个重要的农业特性,叶片作为光合作用的主战场,能调节光合作用从而影响植物的生长和发育。叶片经常改变其结构以适应光照强度、湿度、温度等环境的变化,而适度的卷叶可以通过多种方式提高水稻产量。在形态上,卷叶保持直立姿态,蕞大限度地减少叶片间的阴影,提高植物的整体光合效率。同时卷叶还可以降低气孔导度,减少水分损失,特别是在干旱胁迫条件下。此外,叶片卷曲延迟了叶片衰老,增加有机物的积累。因此卷叶多为植物优良抗逆性的植株表型特征。对于卷叶的形成,水稻中已经发现了几种卷叶的遗传调控因子,包括ROLLED LEAF9/SHALLOT-LIKE1, SHALLOT-LIKE2, ROLLED AND ERECT LEAF1, ROLLED AND ERECT LEAF2, SEMI-ROLLED LEAF1, SEMI-ROLLED LEAF2, ROLLING LEAF14, LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN GENE 等。除了之外,根据以往的研究,叶型的生产与一些转录因子的拮抗表达以及靶标这些转录因子的miRNA的表达相关。MicroRNAs是长度为19-22nt的非编码RNA,他通过与靶基因互补配对,在转录水平负调控靶标基因的表达,根据已有的报道,miRNA在细胞发育、增殖、凋亡等生命过程中发挥了重要的功能,同时在植物水平上,miRNA影响了植物根、茎、叶的发育,同时参与了植物对高温、盐碱、干旱等多个逆境的响应。2018年3月,朱健康团队在Plant Physiology发文Knockdown of Rice MicroRNA166 Confers Drought Resistance by Causing Leaf Rolling and Altering Stem Xylem Development,探究水稻中敲低miRNA166表达从而影响卷叶的生产和木质部的发育从而提高水稻的抗旱能力。

首先作者以STTM技术对水稻37个miRNA家族进行了敲低实验,在自然水田条件下,对转基因植株进行表型分析。在其中发现STTM166系表现明显的农艺性状的改变。在成熟期,与野生型相比,STTM166柱高降低了33.9%(图1 A),同时该敲低系叶片呈现明显的卷叶形态(图1 B)。作者通过RT-qPCR(图1 C)和northern blot(图1 D)显示STTM166系中miRNA166都显著降低。这些结果表明STTM166植株的表型是由MIR166的下调引起的。作者对STTM166系植株进行解刨分析,在成熟期叶片的横截面上,在某些小脉区域敲低系与野生型相比未能形成正常的厚壁组织细胞(图1 E,SC),同时STTM166系植株的泡状细胞(图1 E,BC)被显著排挤,其宽度减少43.9%(图1 F)。除此之外,野生型和STTM166 系在中脉区和次脉区相差不大。因此,厚壁组织细胞的异常和皱缩的泡状细胞都有可能导致STTM166植物的卷叶表型。

转录组测序

图1. STTM166植株表型与鉴定

因为卷叶被认为是适应性的抗旱机制,因为作者想要探究STTM166系是否有更好的抗旱表现。作者在人工气候室中利用盆栽水稻进行抗旱性测定,在幼苗正常生长15天后,进行保水处理模拟干旱。干旱处理10天之后,野生型出现明显叶片枯萎,而STTM166系植株叶片并未枯萎(图2A)。随后进行复水恢复,并记录复水8天后水稻的存活率(以出现新叶长出为存活),结果表明与野生型相比,STTM166系存活率提升了53.2% 和49.3%(图2 B)。在干旱胁迫处理过程中对水稻的水分流失进行了监测,发现STTM166系水稻水分流失低于野生型(图 2 C)。

转录组测序

图 2.  干旱胁迫下存活率的变化

为了证实水分流失数据,作者使用红外成像检查了叶片表面温度。在人工气候室正常生长条件下,STTM166叶片表面温度高于野生型(图3 A),说明STTM166植物叶片蒸腾作用降低。此外,在水田条件下,在白天试验的三个时间点,STTM166植物的蒸腾速率始终低于野生植物(p<0.001)(图3B)。由于蒸腾作用与气孔密切相关,统计发现在正常生长条件下,气孔导度明显降低(图3 C),而与野生型相比,这两个STTM系的叶水势保持不变(图3D)。然而,在干旱胁迫条件下,STTM166系的叶水势明显高于野生型(图3D)。ABA含量的测定表明,在正常和干旱胁迫条件下,STTM166和野生植物的ABA水平相当(图S1)。这些结果表明,STTM166植株叶片水势的增加和蒸腾速率的降低并非由ABA含量的变化所介导,而是更可能是由于STTM166植株叶片和茎的形态变化所致。

转录组测序

图3:干旱胁迫下植物蒸腾作用差异


RNA-seq

图S1.  ABA含量变化

作者对STTM166植物茎的维管束的结构变化进行了解剖分析。与野生型相比,STTM166茎的木质部导管直径明显减小(图4A,XV)。预计STTM166木质部面积的减少会导致茎的水力传导率(kshoot)发生变化。事实上,用高压流量计(hpfm)标准化的茎叶面积对kshoot的测量表明,在人工气候室和水田条件下,与WT相比,STTM166-1和STTM166-2的kshoot分别降低了56.8%和52.7%。(图4B)。有趣的是,作为相互连接的维管系统的一部分,STTM166和野生植物在正常生长条件下,根(图4C)和叶(图4D)的维管束没有表现出显著的形态差异。这些结果表明,MIR166在茎的维管束发育中起着重要作用。这一点通过MIR166定位研究得到了进一步支持。利用LNA-MIR166反义探针原位杂交,在野生植物(包括韧皮部和形成层)的茎维管束中检测到MIR166(图5A),形成层细胞(CB)显示出高水平的MIR166,这可能与MIR166前体形成的起源有关。在STTM166植物中,形成层中只检测到微弱的MIR166信号(图5 A、B)。这表明,由于STTM166植物蒸腾速率降低并不是由于根系的水分吸收差异。根据以往的研究,5个OsHB基因都含有Mi166结合序列,为了确定哪一个OsHB基因调控STTM166的植株表型,作者对STTM166和野生型水稻进行了转录组测序,并通过qRT-PCR验证,结果显示STTM166系水稻中OsHB3和OsHB4的表达明显高于野生型,而OsHB1、 OsHB2、OsHB5并没有明显变化(图5 C、D)。因此OsHB3和OsHB4很可能是水稻miRNA166的主要靶点。通过RLM-RACE实验检测了5个OsHB基因的切割位点,结果显示仅OsHB4基因存在切割(图5 E),因此OsHB4作为MIR166的直接靶点,调控水稻茎部的维管束发育。


RNA-seq

图5. TM166 影响植物的维管束以及miRNA166下游靶基因挖掘

为了对miRNA166靶位点OsHB4进行验证,作者对切割位点进行了同义突变rOsHB4,该突变体序列发生了G-C突变,但氨基酸序列保持一致(图6 A)。随后构建rOsHB4过表达材料,并对其抗旱性进行分析。在苗期,rOsHB4过表达材料表现出卷叶表型,并采用前期相同的干旱胁迫处理对其植株形态和存活率进行统计(图6 D、C),结果显示rOsHB4过表达材料抗旱性明显增强。


RNA-seq

图6 rOsHB4过表达材料表型

利用前期研究STTM166水稻与野生型RNA-seq数据进行分析,有趣的是,已知的非生物应激相关标记基因,如过氧化物酶相关基因、应激反应na等基因在STTM系中与野生型相比没有变化。对差异表达基因进行GO分析,差异基因高度富集于细胞壁组织的生产和多糖代谢(图7 A)。对其中多糖合成酶基因以及CLAVATA1基因进行RT-qPCR,结果显示CSLA3、CESA5、CSLF6、CLAVATA1在STTM166系中都差异表达。利用前人对OsHB基因编码的转录因子motif研究,预测OsHB4结合位点(图7 C),并通过对上述基因的启动子区序列分析,发现上述基因皆含有OsHB4结合位点(图7 D)。由此推断,miRNA166通过切割OsHB4转录本影响OsHB4表达,而OsHB4降低影响了下游靶基因的表达从而影响了细胞壁的形成和维管束的发育。

image.png

图7 不同下游基因的表达模式差异

整篇文章研究内同到此为止,对其研究思路进行概述(如下),首先作者通过构建miRNA敲低材料,在其中发现miRNA166敲低系-STTM166表现出形态学上的抗逆性,对其进行表型、细胞形态以及生理过程进行分析,发现STTM166表现出卷叶、泡状细胞缩小、蒸腾效率降低、失水变慢等优良抗逆表现。随后对其下游靶基因进行确定,通过STTM166与野生型差异表达基因以及差异表达基因RACE实验,发现OsHB4为miRNA166靶基因。同时根据差异表达基因的分析,将OsHB4与细胞壁的形成和维管束的发育基因的关联,对其miRNA166敲低调控叶片卷叶以及茎木质部发育从而提升作物抗逆能力进行阐述。当然,如果文章对OsHB4对靶基因的调控通过更多的实验进行验证,文章故事的完整性与严谨性将提升一个层次,但是不可否认,该文章以清晰的脉络向我们展示了如何探究miRNA参与植物逆境胁迫,具有很好的借鉴意义。


RNA-seq

参考文献

Knockdown of Rice MicroRNA166 Confers Drought Resistance by Causing Leaf Rolling and Altering Stem Xylem Development | Plant Physiology  


本文网址:/news/436.html

关键词:转录组测序,RNA-seq,RNA

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