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QsMYB1直接靶向参与软木橡木(Quercus suber)中木质素和木栓质生物合成途径的基因

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QsMYB1直接靶向参与软木橡木(Quercus suber)中木质素和木栓质生物合成途径的基因

发布日期:2019-03-21 作者: 点击:

软木橡木(Quercus suber L.)是一种常绿阔叶树种,原产于地中海盆地。橡木树皮厚且可持续开采,是宝贵的经济资源。软木(栓木)是由木栓层活性分生组织分化而来的组织,其特点是栓化死亡细胞的分层沉积。高含量的软木脂为橡树提供独特的绝缘体和弹性,这一特性可转化为各种工业应用。尽管软木很重要,但对于软木形成和发展的分子机制,仍然知之甚少。

本研究旨在通过构建QsMYB1::3xFLAG的转基因橡木胚胎利用ChIP-Seq技术鉴定QsMYB1靶基因及进行靶基因的功能分析。结果表明,QsMYB1直接作用于木质素和木栓质代谢途径的基因,证实了QsMYB1在调节软木形成和发育中的特殊作用,这是一种在软木橡木中具有重要意义的特定生物过程;同时也可作非模式生物分析的一种参考思路。


RT-qPCR验证QsMYB1 :: 3xFLAG的表达

构建QsMYB1 ::3xFLAG融合蛋白的过表达载体。之后,对其进行RT-qPCR的分析,与未转化的材料相比,转化材料中QsMYB1 :: 3xFLAG转录物的表达上调了4-12倍(图1a)。此外,Western Blot结果证实了抗Flag抗体和融合蛋白的反应特异性(图1b),并且通过荧光显微镜证实了MYB1 :: 3xFLAG融合蛋白的核定位(图1c)。

ChIP

ChIP-Seq鉴定QsMYB1靶基因

以QsMYB1:: 3xFLAG表达变化倍数高于6的胚胎为材料,用Flag抗体免疫共沉淀DNA,高通量测序之后对QsMYB1结合的靶基因进行鉴定,2个生物学重复。实验共鉴定到18,165个潜在结合位点,分布在14,290个基因的基因区域:其中启动子区域为13.4%,5' UTR为8.1%,内含子区域为19.2%,外显子区域为25.5%,3' UTR为6.5%和终止子区域的6.0%,基因间区域占总结合位点的18.4%,剩余2.9%的结合位点未注释(图2a)。

使用MEME-ChIP对结合位点进行motif分析,结果motif CWHCAA(E-value=3.5e-50),CYTCBTC(E-value = 8.8e-38)和BKTGG(E-value = 2.9e-30)是具有统计学意义的。 BKTGG基序出现在12,308个峰中(67.9%),而CWHCAA和CYTCBTC基序分别在7926(43.7%)和2016(11,1%)峰序列中被鉴定(图2b)。

对QsMYB1的靶基因进行分类统计,得到414个调节基因被QsMYB1结合,其中转录因子类占42%,转录调节因子50.5%及7.5%的染色质调节因子(图3)。

基因表达调控

基因表达调控

QsMYB1靶基因的相对表达量变化

通过RT-qPCR在过表达QsMYB1的转化胚胎(tECL)和未转化的胚胎(ntECL)中评估QsMYB1的5个靶基因:QsGPAT,Qsb-GLU,QsCAD,QsABCG11 QsPOX的基因表达调控水平。结果显示,当QsMYB1靶向在目标基因的5’ UTR(QsGPAT,QsABCG11和POX)或Promoter(Qsβ-GLU)时,基因会出现表达上调。与此相反,靶向在Exonic的QsCAD在过表达的QsMYB1:: 3xFLAG转化胚胎中的表达量会出现下调(图4)。

基因表达定量

结论

通过建立软木橡木胚胎模型,验证标签抗体的特异性及在转化胚胎中成功过表达QsMYB1:: 3xFLAG融合蛋白,使用ChIP-seq对QsMYB1靶向基因进行全基因组分析。QsMYB1显示参与木质素和木栓质生物合成和组装,通过一个复杂的调节网络与靶向酶基因直接关联及其他转录调节元件的基因间接起作用。同时QsMYB1是软木形成和分化的主要调节因子,QsMYB1具有通过调节类苯基丙烷途径的特定基因来调节木质素和木栓质合成过程的能力,这需要进一步的研究来确认。即便如此,生成的数据也是深入了解木栓质生物合成和沉积的起点。 通过开始解开软木形成中涉及的生物合成途径,我们提供了重要的理论,以支持育种计划的发展,例如基于软木代谢工程的设计策略。


参考文献

Capote, T., Barbosa, P., Usie, A., Ramos, A. M., Inacio, V., Ordas, R., & Goncalves, S. (2018). ChIP-Seq reveals that QsMYB1 directly targets genes involved in lignin and suberin biosynthesis pathways in cork oak (Quercus suber). 18(1), 198. doi: 10.1186/s12870-018-1403-5


本文网址:/news/434.html

关键词:ChIP,ChIP-Seq,转基因

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